Masi maumbile mbinu utafiti

Kuchunguza na kubaini variants katika DNA muundo kutumika mbinu Masi maumbile. Kwa kila mkoa DNA, ambayo inahusu ukanda huu wa kromosomu, jeni au aleli, mbinu kutofautiana. Msingi kila maumbile mbinu Masi inajumuisha baadhi au kufanya udanganyifu wa pili wa RNA na DNA. njia hizi zote ni sifa ya utata mkubwa, bila mazingira ya maabara hauwezi kufanyika, na wafanyakazi lazima wenye ujuzi. Kazi hii unafanywa katika hatua kadhaa.

hatua

Kwanza, RNA au DNA sampuli na kuwa na uzalishaji. Hapa, maumbile mbinu Masi inaweza kutumika kwa vifaa karibu yoyote: tone la damu, leukocytes, fibroblasts utamaduni, mucosa (scraped), hata follicles nywele, - DNA zinaweza kupatikana kutoka sampuli yoyote. Ni yanafaa kutumia yoyote ya mbinu Masi maumbile na chaguzi zao mbalimbali na kwa muda mrefu kutengwa DNA kuhifadhiwa waliohifadhiwa. hatua ya pili ni kujitolea na mkusanyiko wa vipande taka (kujiongezea nguvu) ya DNA, kama husaidia kuhakikisha polimerasi katika vitro (katika vitro bila ya ushiriki wa viumbe hai). Matokeo yake, kuchaguliwa DNA kipande hulizidisha na mwitikio huu mlolongo, na kiasi cha DNA kuongezeka literally mamilioni ya mara.

hatua ya tatu katika njia ya molekiuli utafiti maumbile inadhaniwa tele DNA kizuizi (kugawanyika hii, akamtikisatikisa au kukata). Kizuizi walifanya kwa electrophoresis juu Polyacrylamide au agarose gel. Hii mbinu Masi-maumbile ya kusoma DNA kipande inaruhusu kila mtu kuchukua nafasi fulani katika gel. Baada ya hapo, gel ni kutibiwa na ethidium bromidi, uwezo wa kisheria kwa DNA, mnururisho na mwanga ultraviolet, basi kuna uwezekano wa kuchunguza luminescence sehemu. Masi maumbile mbinu za uchunguzi ni mbalimbali na mbalimbali, lakini hatua mbili za kwanza ni za kawaida kwa wote. Lakini ili kutambua vipande DNA, gel yanaweza rangi, na wengi njia nyingine zilizopo.

aina

mbinu ya moja kwa moja na kuenea kwa ajili ya kuchunguza mycobacteria ni pamoja juu Masi DNA maumbile ya kujifunza mbinu. Asili yake ni kwamba, ili kubaini Scan mlolongo nyenzo ya vipande maalum ya DNA ya vimelea vya magonjwa. Masi maumbile mbinu za uchunguzi bado hauna njia bora zaidi ya kutambua magonjwa kama vile kifua kikuu. Kwa kutumia polimeresi (PCR), unaweza kuwa na uhakika kwamba DNA ya awali kuongeza idadi ya nakala katika nyakati milioni, ambayo ni, kutakuwa na kujiongezea nguvu, na itakuwa kuonyesha matokeo. kiwango cha usikivu juu sana - zaidi ya asilimia tisini na tano, ambayo ni faida kubwa ya njia hii.

mapumziko ya njia Masi-maumbile ya utafiti juu ya ufanisi wa mavuno nakala nyingi literally mara mbili, kwa kuwa katika kesi hii ya uandishi sampuli inaonyesha maalum oligonucleotide mlolongo kuongezeka kwa mara mia moja na sita. Hata utamaduni uchunguzi wa kifua kikuu ya mfumo wa upumuaji kwa kiasi kikubwa kupunguza unyeti wake. Hii ndio sababu dawa za kisasa ni msingi mbinu Masi maumbile ya uchunguzi wa kifua kikuu. njia ilivyoelezwa ni nzuri hasa wakati wa kushughulika na vimelea wa juu antijeni tofauti, thibitisha kuwa njia nyingine ni vigumu zaidi - inahitaji maalum media madini na kukuza muda mrefu. Biochemical na Masi mbinu maumbile kuzalisha athari tofauti sana juu ya matokeo.

utambuzi wa kifua kikuu

Marshall PCR uchunguzi wa kifua kikuu kwa kawaida kwa kutumia wale mfuatano wa DNA ambazo ni maalum kwa ajili ya kila aina nne za ugonjwa. Ili kufikia lengo hili mara nyingi hutumia primers vinavyoonyesha mlolongo NI mambo (NI-986, NI-6110), kama mambo haya tabia aina yenye wanaohama Mycobacterium kifua kikuu na mara zote sasa nakala nyingi katika jenomu. Pia DNA uchimbaji unaweza kutekelezwa kutoka tamaduni safi na Hospitali (sputum ya wagonjwa) na mbinu nyingine yoyote kufaa. Kwa mfano, kuna Boom njia ambapo lisisi bafa hutumiwa kulingana na guanidine thiocyanate na silika kama DNA za mtoa huduma. idadi ya wagonjwa ambao ni tofauti vimelea maskini kuongezeka kila mwaka, na kwa hiyo katika matibabu imeanzisha kiwango tofauti kabisa ya shirika: Njia Masi-maumbile ya kusoma DNA imekuwa kucheza nafasi muhimu katika utambuzi.

Hata hivyo, ni lazima kukubali kwamba si bila vikwazo. Mbinu PCR ni matumizi ya mara kwa mara huleta idadi kubwa ya matokeo ya uongo na VVU, na sababu si tu ya kiufundi makosa, lakini pia sifa za njia yenyewe. Aidha, kwa kutumia njia hii ya utambuzi ya kuamua uwezekano wa mycobacteria, ambayo imekuwa kutambuliwa, ni tu haiwezekani. Lakini hasara hii si muhimu. Masi mbinu maumbile ya PCR uchunguzi kuhusisha hatari ya uchafuzi wa DNA mycobacterial. Vyeti mahitaji kwa sababu hii kwamba kwa PCR maabara iliyoundwa kwa ajili tu ngumu, wao wanahitaji majengo matatu tofauti. PCR teknolojia ya kisasa na ngumu sana, ni inahitaji matumizi ya vifaa sahihi na wafanyakazi high-waliohitimu.

bacterioscopy

Wakati matokeo ya uchunguzi wa uchambuzi lazima ikilinganishwa na data nyingine: uchunguzi wa kimatibabu, radiography, smear hadubini, mazao na hata kukabiliana na tiba maalum ni muhimu sana. Katika mfululizo huu, masomo PCR ni moja ya vipengele tu. Tambua kisababishi magonjwa katika utambuzi wa mapema inaweza kuwa rahisi na ya haraka njia - vimelea.

Kuna hutumiwa darubini mwanga (Coloring Ziehl-Neelsen) na umeme (Coloring fluorochromes). Faida ni kasi smear matokeo. Lakini drawback yake ni sawa kuchukuliwa uwezo mdogo kutokana na unyeti chini. Hata hivyo, njia hii ni kutokana na WHO mapendekezo kama zaidi ya kiuchumi na ardhi ili kuchunguza wagonjwa wa kifua kikuu. Kugundua ya mycobacteria vimelea njia ina thamani utabiri na makadirio quantitatively bakteria excretion. Sana kujiamini zaidi ya kukabiliana nayo mbinu Masi maumbile utafiti wa kifua kikuu.

tamaduni

Bora kugundua mycobacteria kutambua mafunzo ya kitamaduni. Kupanda vifaa kiafya ni alifanya ndani ya kati yai: Mordovsky, Finn II, LJ, na kadhalika. Vigezo ya upinzani wa mycobacteria kwa madawa na ushahidi wa moja kwa moja wa ufanisi wa idadi ya mycobacteria na makoloni yao katika vitro, kama njia kutumika kwa utamaduni wa utafiti. Kuongeza asilimia ya kutengwa ya mycobacteria chanjo ya nyenzo kiafya ni uliofanyika mazingira mbalimbali.

Kukidhi mahitaji ya mbalimbali ya utamaduni, ikiwa ni pamoja na ugonjwa wa ruzuku na vinywaji. Kutumika katika mfumo huu na automatiska kufunga mita aina VANTES ukuaji. Mazao lazima kufanyika katika kupevuka kwa muda wa wiki saba hadi nane. Kufikia wakati huu mazao na ukosefu wa ukuaji inaweza kuchukuliwa hasi. Njia bora zaidi ya kuchunguza Mycobacterium kifua kikuu kuzingatia sampuli kibiolojia: uchunguzi vifaa Kuambukiza nguruwe Guinea, ambayo ni rahisi kukabiliwa sana TB.

baadhi ya takwimu

Interesting sehemu ya mafunzo, ambayo ilikuwa kufunguliwa na uchunguzi PCR alikuwa kujifunza M. kifua kikuu - fiche maambukizi. dhana ya kisasa ya maambukizi ya TB unaonyesha kuwa kati ya watu mia waliokuwa katika kuwasiliana na M. kifua kikuu, tisini huweza kuambukizwa, lakini kumi tu wao ni ugonjwa wa unatengenezwa. Wengine wana TB kinga, na kwa sababu asilimia tisini ya matukio ya maambukizi bado latent. Tambua muundo jumuiya hii husaidia maumbile mbinu Masi.

Wataalamu wa kusema kwamba hamsini na mitano asilimia wale ambao mazao ya kuugua vifaa walikuwa hasi, na asilimia themanini ya watu walioathirika na M. kifua kikuu, lakini inapita bila dalili radiographic ya ugonjwa huo, PCR majibu chanya kupokelewa. Ni maumbile uchunguzi mbinu kusaidiwa kutambua wagonjwa hatarini kwa PCR masomo, pamoja na matokeo ya uchambuzi wao (hadubini na utamaduni) walikuwa mbaya, na subclinical maambukizi M. kifua kikuu alikuwepo.

utafiti wa kisasa

Urusi na vimelea maabara kutumia njia kasi ya viwango kabisa: nitrate reductase shughuli ya mycobacteria majaribio na Griess reagent. Vituo Kupambana TB kutumia njia ambayo inaruhusu kuamua upinzani kwa dawa. Hii mbegu katika vyombo vya habari kioevu, ambapo automatiska radiometric na mfumo umeme uhasibu ukuaji wa mycobacteria. Kama uchambuzi unafanyika haraka - hadi wiki mbili.

Hivi sasa, mbinu mpya ni kuwa maendeleo: upinzani dawa ya mycobacteria ni kipimo katika ngazi aina-jeni. Utafiti wa mifumo ya Masi ya jeni pinzani na inaonyesha kuwepo kwa mycobacteria. jeni hizi ni kuhusishwa na upinzani dhidi ya madawa mengine. Kwa mfano, Kasa jeni, Inha, katG sugu kwa isoniazidi, rpoB gene - rifampicin 16Sp RNA jeni na rpsL - streptomycin, emb1 - kwa ethambutol, gyrA - fluoroquinolone na kadhalika.

mutations

utambuzi wa kisasa kwa kiasi kikubwa kuongezeka kwa kiwango cha Mbinu Masi-maumbile kutafiti DNA na kuruhusiwa kufanya tafiti kwa kiwango kikubwa wa mabadiliko katika wigo wao wote. Sasa tunajua kwamba mabadiliko ya kawaida katika 516, 526 na 531 kodoni rpoB jeni, na kutambuliwa upinzani dhidi ya dawa za kulevya mbalimbali. Kuna mbalimbali mzima wa njia za kuandika ya mycobacteria kutumia si tu njia za jadi - biochemical, kibaiolojia na kiutamaduni, lakini pia sana kutumika kisasa mbinu Masi maumbile. Tayari kuna kutosha na kutoa utambuzi njia sahihi kwa ajili ya kugundua magonjwa monogenic. Wao ni msingi wa masomo DNA katika eneo halisi ya jeni maalumu. Hii ni kawaida ya mchakato tata, muda mwingi na gharama kubwa, lakini data kwamba ni zinazotolewa na uchambuzi Masi maumbile, ni zaidi na taarifa sahihi ya data ya uchambuzi zote.

Kwa muda mrefu imekuwa inajulikana kwamba DNA haibadiliki kwa ajili ya maisha yote ya viumbe kuwa ni katika yoyote zenye kiini seli odnakova, na hii inafanya uwezekano wa kuchukua uchambuzi wa kabisa seli zote za mwili, katika hatua yoyote ya ontogeny. gene kuharibiwa yanaweza kutambuliwa kabla kuonekana kwa dalili ya kwanza ya ugonjwa kamili wadogo kliniki, na pia katika watu afya heterozigasi, lakini baada ya mabadiliko katika jeni. Masi maumbile hereditary magonjwa mbinu za uchunguzi kuruhusu kufunua yake (njia moja kwa moja, DNA-uchunguzi), pamoja na kuchambua ubaguzi wa ugonjwa katika familia na marker loci DNA (maumbile polimofisimu), ambayo ni uhusiano wa karibu na jeni kuharibiwa (yaani, mbinu moja kwa moja ya DNA-uchunguzi). Moja kwa moja au pasipo moja kwa moja - uchunguzi wowote DNA ni msingi mbinu za kubaini sehemu madhubuti maalum la DNA ya binadamu.

mbinu moja kwa moja

mbinu moja kwa moja ya utambuzi wa DNA ni wakati culprit gene ugonjwa hereditary inajulikana, pamoja inayojulikana, na aina ya mabadiliko yake. Kwa mfano, zinazofaa mbinu moja kwa moja kwa idadi ya magonjwa. Hii chorea Huntington (ugani CTG-marudio), feniketonuria (R408W), uvimbe wa nyuzi (delF508, kubwa mutations) na kadhalika. Faida kuu ya njia ya moja kwa moja kabisa inayomilikiwa uchunguzi usahihi, na hakuna haja ya kufanya DNA uchambuzi wa mapumziko ya familia. Kama mabadiliko katika jeni inayofanana ukipatikana, inaruhusu hasa kupitisha uchunguzi wa urithi, aina-jeni uamuzi kwa muda wote wa familia mzigo.

Faida nyingine ya uchunguzi wa moja kwa moja ni kuchukuliwa kwa kutambua carrier heterozigasi ya mabadiliko mbaya kutoka kwa jamaa na wazazi ambao walikufa kutokana na ugonjwa huo. Hii ni kweli hasa kwa ajili ya magonjwa autosomal. Hasara ya njia ya moja kwa moja zinapatikana pia. Kuyatumia, unahitaji kujua hasa localize abnormal jeni, Exon-Intron muundo wa wigo wake na mabadiliko yake. Si kila magonjwa monogenic leo kupokea taarifa kama hizo. mbinu Informativeness ya moja kwa moja hawezi kuwa ni kamili, kwa sababu moja na gene moja inaweza kuwa na idadi kubwa ya mabadiliko kiafya ambayo husababisha maendeleo ya magonjwa hereditary.

mbinu moja kwa moja

mbinu moja kwa moja katika uchunguzi wa DNA ni kutumika wakati wote, katika kesi nyingine, ikiwa gene kuharibiwa si kutambuliwa, lakini chromosomally tu, au kama utambuzi line hakutoa matokeo (itatokea, kama gene tata Masi shirika au kiasi kikubwa, kama kuna mengi mutations kiafya). mbinu moja kwa moja kazi ubaguzi uchambuzi wa alama polymorphic katika allelic familia. Alama kupatikana katika kromosomu mkoa huo au mahali maalum ni uhusiano wa karibu na magonjwa na kuwakilisha kufuta au insertions, mabadilisho uhakika, kurudia, na polymorphism yao ni kutokana na kiasi tofauti ya seli katika kuzuia.

rahisi zaidi kwa ajili ya moja kwa moja utambuzi kuchukuliwa microsatellite na minisatellite polymorphisms, ambayo ni sana kusambazwa katika genome binadamu. thamani yao walionyesha katika maudhui ya habari, ikiwa uharibifu wa umbali jeni kati marker na gene si kubwa sana. Katika kesi ya pili, usahihi makadirio imedhamiria kwa kiasi kikubwa mzunguko wa uchanganyishaji kati marker polymorphic na uharibifu. mbinu moja kwa moja uchunguzi pia kutoa lazima awali hatua ya aleli masafa ya utafiti kuchambuliwa idadi ya watu kati ya wagonjwa na flygbolag ya mabadiliko, pamoja na umuhimu wa kuamua uwezekano wa uchanganyishaji wa nonequilibrium na kujitoa alama na aleli mutant.

njia nyingine

Short makundi ya RNA au DNA, pamoja na jeni moja visualized chini ya masomo microscopic haiwezi, kwa hiyo, kwa kutambua mabadiliko zinahitajika kwa utambuzi Masi maumbile. Kuna "Jenomu ya Binadamu Mradi", pamoja na maendeleo ya wengine katika jenetiki ya molekiuli sana kupanua uwezekano wa utambuzi wa magonjwa hereditary - wote kabla na baada ya kuzaa. Mbinu hizi inaweza kutoa kutambua mapema na kufanya utabiri aina nyingi- na magonjwa monogenic, ambaye kwanza hufanyika katika utu uzima. Kwa bahati mbaya, kutokana na uwezo wa kiufundi wa masomo Masi maumbile wakati mwingine zaidi ya mipaka ya kimaadili ambayo yamewekwa kuhusiana na urithi, hasa wakati uchunguzi ni katika ujana na utoto.

Kimuundo na namba matatizo ya kromosomu ni sababu ya kawaida ya ugonjwa na kansa, na kusababisha ulemavu wengi. aberrations kromosomu haja ya kuwa na kutambuliwa, ambayo ni muhimu kwa ajili ya ushauri familia - kutathmini utabiri, pamoja na hatari ya uzazi mimba baadaye. Kromosomu uchambuzi ni "dhahabu" katika utambuzi maumbile, lakini ni mdogo. Tu njia za uchambuzi Masi maumbile inaweza kufanya zaidi, kwa sababu kuna kutumika cloning teknolojia kulingana umeme maandiko uwezo wa hisia zao juu ya kutambua mabadiliko kromosomu pambanuzi ambayo ni vigumu kuchunguza classical masomo cytogenetic. Mbinu hizi zinazidi kupanua uwezo wetu uchunguzi, wakati kuchunguza, watoto wenye ulemavu wa maendeleo, ulemavu wa akili, na magonjwa mengine mengi hereditary.

matokeo ya utafiti

Ni muhimu sana kwa ajili ya ubinadamu na muundo wa jeni na kazi ya elimu, aina ya tofauti, uwezo wa kuchunguza magonjwa hereditary zilizotokea kuhusiana na maendeleo ya jenetiki ya molekiuli. mbinu yake yana lengo la utafiti wa molekuli ya DNA - na wakati ni ya kawaida, na wakati ni kuharibiwa. Maandalizi ya Utaratibu deoksiribonyuklei acid wa nyukleotidi (DNA) inaenea katika hatua kupokea sampuli ya kutambua vipande ya mtu binafsi. Kutengwa wa jenomu DNA kutoka seli, kizuizi (kuchanika), kujiongezea nguvu (cloning), electrophoresis ya vipande (kutenganisha malipo yao ya umeme na uzito Masi na gel agarose). Ubainishaji wa vipande maalum ziko juu ya uso wa mstari za kipekee.

Kisha kuingia katika tendo filters maalum, kwa njia ambayo hupita kila kuchanganywa kipande kwa vipande cloned DNA au synthetic probes mionzi ni udhibiti, ambayo itakuwa sawa na kila sampuli mtihani. Ukibadilisha msimamo au urefu ikilinganishwa na uchunguzi, kama kipande mpya au kutoweka - wote huu unaonyesha kwamba jeni kuchambuliwa na kufanyiwa marekebisho katika mlolongo wa nyukleotidi. Kuna nane mbinu za msingi za masomo Masi maumbile: mpangilio (uamuzi wa DNA), polimerasi (kuongezeka kwa idadi ya mfululizo wa), maandalizi ya primers inayojulikana jeni, DNA cloning, uzalishaji wa molekuli recombinant inayotokana protini kutokana na molekuli recombinant, kujenga seti kamili (ukusanyaji maktaba) cloned vipande kwamba walikuwa kupatikana kwa kutumia kizuizi.